Né le 4 juillet 1929 à Medellin (Colombie), Darío Castrillón Hoyos commence ses études au séminaire de son diocèse et les poursuit à Rome à l'université Grégorienne où il obtient un doctorat en droit canonique. Il se spécialise en sociologie religieuse, en économie politique et en éthique économique. Ordonné prêtre le 26 octobre 1952 à Rome, il retourne en Colombie et devient vicaire de paroisse en campagne. Directeur des Cursillos de Cristianidad, de l'action culturelle populaire, il est aussi official à la Curie diocésaine et délégué à l'Action catholique. Nommé secrétaire général de l'épiscopat colombien, il assume aussi la chaire de droit canonique à l'université civile libre.
Le 2 juin 1971, il est nommé coadjuteur de l'évêque de Pereira, auquel il succède le 1er juillet 1976. Dans cette ville située au cœur de la région productrice de café, il s'en prend à la police qu'il accuse de tuer les prostituées, les enfants des rues et les mendiants. Il rencontre aussi Pablo Escudar, le chef du cartel de Medellin abattu par les forces de l'ordre en 1993, et tente de jouer le médiateur avec l'État colombien.
Secrétaire général du conseil épiscopal latino-américain (CELAM) de 1983 à 1987, il en devient le président de 1987 à 1991. Le 16 décembre 1992, il est promu archevêque métropolitain de Bucaramanga. Le 15 juin 1996, Jean-Paul II l'appelle à devenir pro-préfet de la congrégation pour le clergé. Lors du synode des évêques pour l'Amérique en 1997, il assure la charge de président délégué, puis celle de membre du conseil post-synodal. Jean-Paul II le crée cardinal le 21 février 1998, et le nomme également le 13 avril 2000 président de la commission pontificale Ecclesia Dei, chargée de s'occuper du clergé et des fidèles ayant quitté Mgr Lefebvre pour rejoindre Rome.